Il rejoint ensuite l'Akatsuki (organisation criminelle constituée de neuf ninjas de rang S). Son anneau est « le pourpre » (朱, Shu?), qu'il porte à l'annulaire droit. Pour le compte de cette organisation, il recherche Naruto pour lui extraire Kyûbi, le démon-renard à neuf queues scellé dans son corps (il recherche aussi les huit autres démons).
Dans l'Akatsuki, Itachi fait équipe avec Kisame Hoshigaki. Itachi est à l'origine de l'association de Deidara avec l'Akatsuki, et provoque le départ d'Orochimaru, ayant vaincu celui-ci grâce à son Sharingan. On note au fil des chapitres que sa dévotion envers l'Akatsuki est sans faille. Itachi reste un personnage dont les motivations se dévoilent au compte-goutte. Après la mort d'Itachi, on apprend que celui-ci n'avait aucune confiance en Madara et qu'il a intégré l'Akatsuki pour surveiller de l'intérieur la dangereuse organisation, et particulièrement Madara qui en voulait à Konoha.
Après la mort du 3e Hokage, Itachi fait un passage dans son ancien village avec son partenaire Kisame Hoshigaki, dans le but de récupérer Naruto et le démon Kyûbi. Selon Madara, le but réel de cette visite était de notifier aux anciens de Konoha qu'il était toujours en vie et qu'ils n'avaient pas intérêt à toucher à Sasuke.