Nous en savons peu sur le passé de Tsunade. Petite-fille du premier Hokage du clan Senju (dont elle ne porte pourtant pas le nom), elle est titrée « princesse » (姫, hime?) par les anciens du village.
On peut la voir encore jeune dans certains Flashback de Jiraya lors du premier entrainement des clochettes avec le troisième Hokage, en compagnie d'Orochimaru et de Jiraya attaché à un poteau. À cette époque elle possédait déjà une force surhumaine, un peu comme Sakura à l'heure actuelle, puisqu'on la voit projeter Jiraya au loin d'un coup de poing, ou qu'on apprend qu'elle a grièvement blessé ce dernier lorsqu'il espionnait les filles aux sources chaudes.
Sa relation avec Jiraya ressemble fortement à celle entre Naruto et Sakura : le comportement moqueur et espiègle de ces deux là envers leurs camarades étant la plupart du temps la principale source de conflit au sein du groupe.
Elle a traversé une période difficile lors de la grande guerre des ninja, en ayant subi notamment deux chocs émotionnels lors de la mort de son petit frère Nawaki et de son fiancé Dan. Elle a depuis développé une sorte de phobie du sang (hématophobie), allant même jusqu'à être tremblante et terrorisée, et ne plus pouvoir faire un seul mouvement lors de son combat contre Kabuto Yakushi lorsque celui-ci se poignarde la main.
Elle a alors décidé (comme Jiraiya) de quitter le village, en compagnie de son apprentie Shizune, voyageant à travers le monde de ville en ville. Elle s'est forgée une réputation de « Légendaire Perdante » à force de perdre aux jeux de casino, de hasard, etc.
Après la mort de Hiruzen Sarutobi, le troisième hokage de Konoha, Naruto et Jiraya partent en mission dans le but d'aller chercher Tsunade, et de lui proposer de devenir le cinquième hokage. Ils finissent par se rencontrer, mais Orochimaru l'a trouvée avant eux. S'ensuit une période de négociation entre elle et Orochimaru, qui lui proposera de ramener à la vie les deux personnes à qui elle tient le plus en échange du soin de ses bras.
Lors de sa rencontre avec Naruto elle affirme que seul un idiot voudrait être hokage, ce qui met Naruto en colère. Il lui propose de l’affronter ce qu’elle accepte. Au moment où il essaye d’utiliser le Rasengan, qu’il ne maîtrise pas encore, elle lui met une pichenette sur le front qui le projette au loin et le met à terre. Elle défie alors Naruto de maîtriser le rasengan en une semaine en échange de quoi elle lui offrirait son précieux pendentif qu’elle tient du premier Hokage. Ce pendentif a une grande valeur à ses yeux et c’était la première fois qu’elle le mettait en jeu dans un pari, malgré sa fièvre du jeu.
Elle refusera la proposition d'Orochimaru (feignant d'accepter pour tenter de l'assassiner), et avec sa force combinée à celle d'un Jiraya affaibli par une drogue qu'elle lui avait fait consommer, elle parviendra à faire fuir son adversaire (Orochimaru avait cependant, à la suite de son combat contre son ancien sensei, perdu l'usage de ses bras, il ne pouvait donc utiliser aucune technique[1], ni s'en servir pour le combat au corps-à-corps, ce qui l'a considérablement affaibli[note 1]).
Elle devient dès lors le cinquième Hokage (Godaime Hokage) de Konoha, et son visage apparaît sur le « mur des Hokage » dès le début de la seconde partie. Pendant la coupure entre la première et la seconde partie, elle prend Sakura Haruno comme élève et lui enseigne le ninjutsu médical, ainsi que le secret de sa force phénoménale. A force de rester auprès d'elle, Sakura commence à avoir le même tempérament que Tsunade, ce qui effraie plus d'une fois Naruto, Jiraiya ou Kakashi[réf. nécessaire].
Elle invoque également les limaces pour protéger les villageois et les ninjas lors de l'attaque de Pain, et se sert de sa réserve de chakra colossale afin de soigner les ninjas et les blessés. Attaquée par Shuradou (le « meurtrier » de Jiraiya) et à bout de force (ayant consommé tout son chakra pour les habitants de Konoha), elle est sauvée in extremis par Naruto qui détruira le corps d'un seul coup. Naruto lui propose alors d'aller boire un thé et de se reposer.
Ayant consommé trop de chakra pour protéger tous les villageois, elle se retrouve à la fin des combats dans le coma et ne peut plus assurer sa charge de hokage. Alors que le daimyo du pays du feu s'apprête à nommer Kakashi Hokage après la mort de Danzô, un messager intervient pour annoncer que Tsunade s'est réveillée.
Elle reprend rapidement sa place une fois remise et organise l'alliance shinobi avec les quatre autres kage. Elle seule s'oppose, en vain, à la décision collective de cacher les deux porteurs de biju restants, Naruto et Killer Bee.